思科生物公司(SignaGen)是一家專(zhuān)注于開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)基因轉導工具的企業(yè),服務(wù)于生物醫學(xué)研究領(lǐng)域。借助我們獨有的技術(shù)平臺(專(zhuān)利申請中,美國專(zhuān)利商標局號碼為 072308和61135606)，SignaGen已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)出三大類(lèi) DNA/siRNA轉染試劑，經(jīng)驗證我們的產(chǎn)品比市場(chǎng)上主導產(chǎn)品效率更高，細胞毒性更低。更重要的是我們提供一個(gè)合理的價(jià)位。
1.生物可降解聚合物(BDP)合成：
BDP技術(shù)是我們的專(zhuān)利技術(shù)，這種技術(shù)讓我們能合成生物可降解聚合物。與其他陽(yáng)離子聚合物如聚(賴(lài)氨酸)和聚(乙烯亞胺)和陽(yáng)離子脂質(zhì)體不同，這種新型聚合物具有一個(gè)獨特的主鏈，它可以攜帶?DNA/siRNA進(jìn)入哺乳動(dòng)物細胞內并被降解(如圖1)，并且細胞毒性很小。此外，這個(gè)新型聚合物擁有卓越的核酸聚合物親和力、高緩沖能力、滿(mǎn)足了一個(gè)好的基因載體的基本設計準則。體外DNA轉染實(shí)驗表明這種新型聚合物傳遞DNA到HEK293T細胞的速度是聚(乙烯亞胺)的2~10倍。
圖1：可生物降解的聚合物DNA轉染示意圖
2.病毒蛋白質(zhì)模擬（VIPs）技術(shù)：
基因治療是先進(jìn)的技術(shù)，它通過(guò)基因傳遞和表達來(lái)治療人類(lèi)遺傳病和后天獲得性疾病。而安全，有效，可控的基因載體是基因治療臨床成功的一個(gè)先決條件。雖然病毒載體傳遞基因的效率很高，其潛在的免疫原性和安全性增加了其在臨床應用的風(fēng)險。我們開(kāi)發(fā)了VIPs技術(shù)來(lái)模擬病毒核酸靶向肽序列，用它來(lái)替代病毒載體。依托VIPs技術(shù)平臺，一系列模擬病毒核酸靶向肽序列(例如，慢病毒)被創(chuàng )建，合成和篩選出來(lái)。據證實(shí)，與脂質(zhì)體結合的DNA轉染試劑，這些模擬肽序列能夠穿透細胞核膜孔，從而使DNA
/ siRNA直接進(jìn)入細胞核(圖2)。初步結果表明，一些模擬肽序列在各種哺乳動(dòng)物細胞中能顯著(zhù)提高以脂質(zhì)體為基礎的基因傳遞效率。有趣的是這種協(xié)同效應在難轉染的非分裂細胞中發(fā)現，同時(shí)為難轉染的細胞提供一個(gè)潛在的非病毒核酸載體。
圖2.具備VIPs模擬肽的脂質(zhì)體轉染試劑的協(xié)同作用
3.轉染介導的細胞毒性去除技術(shù)：
在DNA/siRNA轉染期間，會(huì )遇到以下轉染技術(shù)困境：高效率的轉染試劑通常還有很強的細胞毒性。有時(shí)毒性太強，在轉染之后大量細胞死亡。因此，研究人員通過(guò)降低轉染效率來(lái)?yè)Q取相對健康的轉染細胞。我們現在提供了一個(gè)解決方案，以實(shí)現最大的轉染效率。通過(guò)除去轉染介導的細胞毒性來(lái)保持相對良好的細胞活力。經(jīng)過(guò)多年的研究，我們發(fā)現它是轉染復合物粘在細胞邊緣導致細胞毒性(圖4，上圖)。由于轉染復合物的性質(zhì)，所以轉染后更換培養基是不可能洗去復合物的。我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)獨有的產(chǎn)品。幾種化學(xué)物質(zhì)被混合制成混合物(正在申請專(zhuān)利，美國專(zhuān)利商標局專(zhuān)利號為# 62375686)在室溫下孵育5分鐘被證實(shí)能有效的去除所有結合到細胞邊緣的轉染復合物(圖4，下圖)，從而消除了轉染介導的細胞毒作用。
圖 3.如何去除轉染介導的細胞毒性技術(shù)運作圖
4. pH依賴(lài)的構象變化(PDCC)是最有效的siRNA轉染技術(shù)：
脂質(zhì)體或聚合物試劑通常能有效傳遞DNA，他們未能有效地驅使siRNA到哺乳動(dòng)物細胞內。轉染siRNA的脂質(zhì)體或者聚合物轉染效果不佳，這可能與siRNA陰離子片段長(cháng)度有關(guān)。siRNA陰離子片段太短以至于用陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物難以維持靜電內聚力。因此，siRNA的脂質(zhì)體復合物或復合物的分解很容易由于接觸聚陰離子細胞表面。我們用特定的疏水基修飾了脂質(zhì)體和聚合物，這些疏水基在生理PH條件下導致Ph依賴(lài)的構象變化(PDCC)，極大的穩定了siRNA脂質(zhì)體和聚合物。由PDCC技術(shù)引起的一個(gè)重要特性是添加一個(gè)病毒大小的特殊疏水基團就可以穩定siRNA脂質(zhì)體或者聚合物從而達到比較好的siRNA的轉染效果。
圖4：PDCC技術(shù)的工作原理圖.
5. 最大量生產(chǎn)腺病毒的Ad.MAX 技術(shù)：
Ad.MAX?技術(shù)主要是通過(guò)基因修飾病毒包裝細胞、HEK293細胞、腺病毒穿梭載體或者腺病毒基因組來(lái)實(shí)現腺病毒生產(chǎn)最大化。這個(gè)專(zhuān)有技術(shù)的核心是通過(guò)遺傳工程的方法使得HEK293細胞中腺病毒復制區保持完整而病毒蛋白的表達受到極大抑制。通過(guò)腺病毒基因組中的反式成分識別HEK293細胞中的抑制區域，Ad.MAX系統允許最大腺病毒產(chǎn)生和最低蛋白的表達。這個(gè)體系對包裝腺病毒載體含有感興趣的毒性基因非常有用；這些毒性基因在伴隨腺病毒復制和增殖的時(shí)候會(huì )殺死HEK293細胞，導致腺病毒產(chǎn)量大幅降低。最終，Ad.MAX技術(shù)可以讓研究人員利用腺病毒構建所有(＜7.5 KB)的基因。
圖5：Ad.MAX技術(shù)的工作原理
6. 多途徑產(chǎn)生超感染性、超高滴度腺相關(guān)病毒顆粒：
與腺病毒不同，用常規的生產(chǎn)程序很難獲得高濃度的rAAV。通過(guò)采用以下多重方式，我們能成功的得到超感染性(比傳統的腺相關(guān)病毒的感染能力高出30多倍)，且腺相關(guān)病毒顆粒達到超高滴度(可達1E+15 VG)。
–?AAV HT包裝細胞：我們已經(jīng)篩選了不同的 HEK293細胞類(lèi)型并且開(kāi)發(fā)出一高產(chǎn)量細胞株——AAV HT包裝細胞，經(jīng)過(guò)我們驗證這個(gè)包裝細胞生產(chǎn)rAAV顆粒是常規的HEK293的10倍多。
– 修飾rAAV?順式載體：顧客可以選擇轉基因中截去WPRE區域下游的部分作為rAAV?順式載體 。有WPRE區域的rAAV?順式載體產(chǎn)生rAAV微粒是沒(méi)有WPRE的8倍多。
– 修飾rAAV外殼：rAAV外殼包含一些特殊位點(diǎn)的突變可以加強（體內、外30多倍）rAAV轉染效率?？蛻?hù)可以運用突變的外殼來(lái)包裝rAAV，以此來(lái)生產(chǎn)更多的感染性rAAV載體。
–?包裝雙鏈腺病毒（dsAAV）：雙聯(lián)AAV也可稱(chēng)為自我互補AAV。它在體內外有高達50倍的轉染效率。定制服務(wù)就是生產(chǎn)和包裝?以scAAV為載體的感興趣基因片段。詳情見(jiàn)圖6。
–?兩次氯化銫超速離心優(yōu)化程序:這個(gè)優(yōu)化程序的主要特點(diǎn)在于樣本超速離心前，用特殊配制的去污劑對轉染的細胞進(jìn)行3次循環(huán)冷凍、解凍和預沉淀的處理。這個(gè)程序產(chǎn)生超純(臨床實(shí)驗級)、超感染的高產(chǎn)量的腺相關(guān)病毒載體。詳情見(jiàn)圖7。與傳統生產(chǎn)程序的差別用紅色標示在框架中。
圖6. 生產(chǎn)超感染性、超高滴度腺相關(guān)病毒顆粒示意圖
圖7.優(yōu)化程序和傳統程序的比較和基本步驟。優(yōu)化程序中的不同用紅色標示在框架中。
* 有些限制條款可能適用于定制scAAV生產(chǎn)和包裝服務(wù)。
